Cancer Discovery | 中美科学家合作首次利用CRISPR全基因组筛选技术改进CAR-T细胞治疗胶质母细胞瘤的效果

胶质母细胞瘤（GBM）是致死性最高的恶性肿瘤之一，目前没有有效的治疗方法，严重威胁人类的健康。CAR-T（Chimeric Antigen Receptor T-Cell）细胞疗法是一种新型的精准靶向肿瘤的免疫疗法。从肿瘤患者外周血分离T细胞，通过基因工程技术将针对肿瘤细胞表面抗原的CAR（肿瘤嵌合抗原受体）导入T细胞表达并回输患者体内，CAR-T细胞通过能够特异性识别肿瘤细胞的抗原并通过免疫作用释放大量的多种效应因子，高效地杀灭肿瘤细胞。CAR-T细胞治疗已经在血液肿瘤中取得了巨大成功，但是在实体肿瘤中进展相对缓慢。在GBM患者中，CAR T细胞疗法已显示出临床可行性和安全性的早期证据， 然而其总体结果仍然不能令人满意，促使人们努力寻求提高靶向GBM的CAR T细胞的抗肿瘤效力的新方法和新策略。

近日，西湖大学生命科学学院谢琦研究员和希望之城国家医学中心（City of Hope National Medical Center）Christine Brown 教授，加州大学圣地亚哥分校(UCSD) Jeremy Rich教授作为共同通讯作者（City of Hope的王东睿博士为排名第一的第一作者）合作在Cancer Discovery 杂志上发表题为”CRISPR Screening of CAR T Cells and Cancer Stem Cells Reveals Critical Dependencies for Cell-Based Therapies”的研究论文。该项研究利用基于CRISPR 基因编辑系统的全基因组功能缺失性文库分别对于CAR-T细胞和胶质瘤干细胞（GBM中恶性程度最高的细胞群）进行高通量无偏向的筛选，发现了多个能显著提高靶向GBM的CAR T细胞抗肿瘤效力的新靶点。为最大化地实现该项研究的临床价值，作者选用了靶向GBM表面蛋白IL13Rα2 的CAR-T细胞，该治疗方法已在City of Hope医学中心主持的多项临床研究中应用于复发脑肿瘤病人，并且已在一位病人中实现多发肿瘤灶的完全缓解（Brown et al, N Eng J Med, 2016）。

在CAR的基础上进一步对人类T细胞进行基因编辑一直是免疫治疗的难点之一，在第一部分针对CAR-T细胞的筛选实验中，作者分别使用慢病毒和电转的方法导入SgRNA文库和Cas9蛋白，从而实现了在CAR T细胞中同时引入功能缺失性文库的目的。这些细胞在体外和过量的GBM患者来源的高表达IL13Rα2的胶质瘤干细胞共培养，然后通过流式细胞仪富集PD1（PD1 是 T细胞耗竭的一个重要Marker）阳性和阴性的CAR-T细胞进行建库测序。研究者在两个不同T细胞供体构建的CAR-T细胞中发现了220个共同基因可以调控CAR-T细胞抗肿瘤活性（图1）。 这些基因中有一部分是已知的参与T细胞活化或T细胞衰竭的调控分子，也从一个侧面验证了该筛选的可靠性。

图1:在CAR-T细胞中进行CRISPR 全基因组筛选

作者接着挑选了4个排名靠前且在CAR-T细胞中功能未知的基因（TLE4,IKZF2,EIF5A,TMEM184B）进行验证。体外实验显示在CAR-T细胞中敲除这些基因都可以显著增加CAR-T细胞对肿瘤的杀伤，增加CAR-T细胞增殖并且抑制CAR-T细胞耗竭（图2）。

图2:敲除TLE4等基因增加体外CAR-T细胞的抗肿瘤效应

作者还进一步利用RNA 测序探索了这些基因的分子作用机制。在TLE4或IKZF2 敲除CAR T细胞中，T细胞活化信号传导相关通路的重要分子（TCR信号，T细胞活化，AP-1和ZAP）被激活，使得其从耗竭状态中解脱出来， 维持其对肿瘤的杀伤功能。TMEM184B或EIF5A 敲除也诱导了类似T细胞活化信号通路的激活，但是和TLE4或IKZF2敲除不同的是，敲除TMEM184B或EIF5A不会上调细胞因子分泌和应答信号通路。作者进一步通过单细胞测序发现，和对照组相比，TLE4敲除的CAR-T细胞具有更多分泌大量细胞毒性因子的细胞亚群而IKZF2敲除则降低了Treg细胞亚群的比例并且上调了IFNG, CCL3等激活T细胞因子的表达。令人欣喜的是，针对GBM PDX小鼠模型的体内实验显示，和对照组相比，敲除TLE4或IKZF2的CAR-T显著增强对肿瘤的杀伤，能够长时间抑制肿瘤的形成，延长小鼠的生存期（图3）。

图3:敲除TLE4或IKZF2的CAR-T细胞显著提高对于小鼠GBM模型的治疗效果

在第二部分筛选实验中，作者利用类似的CRISPR 筛选策略在肿瘤干细胞中进行了筛选，发现了RelA,NPLOC4等多个显著调控GSC对CAR-T细胞杀伤敏感性等新靶点，并在体外和体内模型中验证了其功能。对其作用机制的探索显示这些基因可能参与了抑制肿瘤细胞分泌炎性细胞因子的作用。

总结一下，该项研究首次在CAR T细胞和其靶向的胶质瘤干细胞中实现了CRISPR功能全基因组筛选，发现并鉴定了一系列可调节CAR T细胞抗肿瘤潜能的基因，提供了通过基因编辑分子靶向技术增强CAR T细胞的抗肿瘤功效的新策略。该项研究建立的高通量筛选平台可以推广到不同靶点的CAR T细胞以及其他过继性细胞转移疗法中，用以获得具有临床收益潜力的可靠靶标。

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原文链接：

https://cancerdiscovery.aacrjournals.org/content/early/2020/12/16/2159-8290.CD-20-1243.full-text.pdf